瀏覽數(shù)量： 0 作者： 本站編輯 發(fā)布時(shí)間： 2024-06-03 來(lái)源： 本站
微生物分離與純化是從混合菌群中獲取單一菌株的關(guān)鍵過(guò)程。本文以分離土壤中放線菌、真菌、細(xì)菌為例，介紹了平板分離法在微生物分離與純化中的廣泛應(yīng)用。由于其簡(jiǎn)便性和高效性，平板分離法能夠通過(guò)不同的分離技術(shù)和合適的培養(yǎng)基，有效獲得純菌株，確保后續(xù)研究和應(yīng)用的準(zhǔn)確性。
1、稀釋涂布平板法
稀釋涂布平板法是一種通過(guò)梯度稀釋菌液，并將其涂布在固體培養(yǎng)基表面，最終形成單個(gè)菌落的方法。其原理在于，在稀釋度足夠高的菌液中，聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。
具體步驟如下：
1）倒平板
將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基溶解并冷卻至55~60℃，分別加入特定的添加劑并混勻后倒入培養(yǎng)皿，每種培養(yǎng)基倒3皿（重復(fù)）。
2）制備土壤稀釋液
a、 稱取土壤：稱取10g鮮土，放入含有90ml無(wú)菌水和玻璃珠的錐形瓶中。
b、混合土壤：在150r/min的搖床上震蕩30分鐘，使土壤與水充分混合，菌體完全分散。
c、逐級(jí)稀釋：
吸取1ml土壤懸液注入第一支含有9ml無(wú)菌水的試管中，震蕩混勻。
從第一支試管中吸取1ml懸液，注入第二支含有9ml無(wú)菌水的試管中，震蕩混勻。
重復(fù)此過(guò)程，依次制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀釋度的土壤溶液，待用。
3）涂布
a、制備平板：將滅菌的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待平板冷卻后使用。
b、涂布過(guò)程：將10-2和10-3稀釋度的土壤菌懸液涂布在平板上進(jìn)行放線菌的形態(tài)觀察培養(yǎng)；將10-4和10-5稀釋度的土壤菌懸液涂布在平板上進(jìn)行真菌形態(tài)的觀察培養(yǎng)；將10-6和10-7稀釋度的土壤菌懸液涂布在平板上進(jìn)行細(xì)菌的形態(tài)觀察培養(yǎng)。
c、涂布技巧：先從下向上推開(kāi)，再左右推開(kāi)，后在培養(yǎng)基上半部分充分推開(kāi)，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)基，將下半部分轉(zhuǎn)至上方，重復(fù)上述推開(kāi)操作。在轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中，涂布器不可伸出培養(yǎng)皿外，最后由中間向外轉(zhuǎn)圈涂布，再由外向內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)圈涂布均勻。
4）培養(yǎng)
倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)菌培養(yǎng)48小時(shí)，真菌和放線菌培養(yǎng)168小時(shí)。
5）純化
挑取單菌落進(jìn)行分離純化3～4次，得到細(xì)菌純種。
2、平板劃線法
平板劃線法是一種通過(guò)在平板表面劃線稀釋樣品以獲得單菌落的方法。其原理在于，每次劃線都會(huì)導(dǎo)致接種環(huán)上的菌體分布更為疏松，最終實(shí)現(xiàn)單菌落的分離。
具體步驟如下：
1）劃線區(qū)劃分
將一個(gè)平板分為A、B、C、D四個(gè)區(qū)域，面積由小到大排列。
2）劃線過(guò)程
使用接種環(huán)在每個(gè)區(qū)域劃線，逐步稀釋菌體，A 區(qū)為待分離的菌源區(qū)，B和C區(qū)為初步劃線稀釋的過(guò)渡區(qū)，D區(qū)（面積最大）則為關(guān)鍵的單菌落收獲區(qū)。
3）培養(yǎng)
培養(yǎng)后觀察D區(qū)單菌落，并進(jìn)行分離純化。
培養(yǎng)基選擇
培養(yǎng)基類型選擇：根據(jù)微生物種類和生長(zhǎng)需求選擇合適的培養(yǎng)基類型，如固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。
營(yíng)養(yǎng)成分：根據(jù)微生物的生長(zhǎng)需求選擇合適的碳源、氮源、礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分。
酸堿度調(diào)整：調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度以適應(yīng)微生物生長(zhǎng)。
培養(yǎng)條件：根據(jù)微生物需求調(diào)整溫度、濕度和光照等培養(yǎng)條件。
常見(jiàn)問(wèn)題
Q1：為什么在平板劃線中，每次劃線前都要灼燒接種環(huán)？
A1：每次劃線前灼燒接種環(huán)以殺死殘留菌種，確保下次劃線的菌種純度。
Q2：用平板劃線法分離菌種，怎樣保證得到相互分離的菌落？
A2：劃線時(shí)估計(jì)樣本中菌的數(shù)量，調(diào)整兩區(qū)間的重疊線數(shù)。第一區(qū)一般很少能出來(lái)單個(gè)菌落，因此占平板面積不要太大，大面積留給后幾區(qū)。
Q3：如何確定平板上的單菌落是否為純培養(yǎng)？
A3：將單個(gè)菌落再次劃線或稀釋分離，如形成的單菌落形態(tài)單一，即為純種菌落。
Q4：培養(yǎng)基接種后為何要倒置培養(yǎng)？
A4：①防止冷凝水滴落污染培養(yǎng)基；②防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)；③某種程度上防止菌落蔓延。
Q5：無(wú)菌操作的要點(diǎn)是什么？
A5：①保持試管口、瓶口或培養(yǎng)皿開(kāi)縫處靠近酒精燈火焰區(qū)（保持無(wú)菌環(huán)境）；②試管口不向上，減少污染；③及時(shí)清除接種遺留物品，防止污染；④不同菌種接種時(shí)做好標(biāo)記，避免混雜。
